Особенности соотношения полов плода при прогрессирующей и неразвивающейся беременности, наступившей в результате вспомогательных репродуктивных технологий

Введение

Соотношение полов при рождении является эволюционным механизмом, способствующим выживанию любой популяции. Данный показатель является относительно стабильным для всей человеческой популяции и для отдельных регионов. Так, по данным Worldstat.info (http://en.worldstat.info/World ) [1][2] соотношение полов в мире составляет 1,078 (муж/жен) в пользу младенцев мужского пола. При этом, в России данное соотношение несколько ниже и составляет 1,058-1,060 [3][4], также в пользу младенцев мужского пола. В зависимости от стадии онтогенеза различают первичное, вторичное и третичное соотношение полов.  Первичное — это соотношение полов в зиготах после оплодотворения (ПСП); вторичное — соотношение полов при рождении (ВСП) и, наконец, третичное — соотношение полов зрелых, способных размножаться особей популяции (ТСП) [1][2].Установлено, что, несмотря на то, что при гаметогенезе сперматозоиды, содержащие Х или Y хромосомы, производятся примерно в одинаковой пропорции, теоретически этот механизм обеспечивает примерно равные доли полов при зачатии. Однако, на ВСП влияет множество факторов: отношение скоростей старения   и гибели Х- и Y-несущих сперматозоидов  в организме самца, способность их достичь яйцеклетки и ее оплодотворить, сродство яйцеклеток к Х- или Y-спермиям. Отмечена и разная жизнеспособность мужских и женских эмбрионов на разных стадиях эмбрионального развития. Большинство исследователей отмечает, что число плодов мужского пола, погибших во время утробной жизни, в 2-4 раза превышает число женских [5].Считается, что соотношение полов человека является результатом двух процессов: гормональной активности родителей в период преконцепции, а также — материнского стресса, который вызывает выработку андрогенов надпочечников, что приводит к селективному самопроизвольному аборту эмбрионов мужского пола. Оба эти обстоятельства являются важными факторами, обусловливающими ВСП при рождении.

Orzack et al. (2015) [6], анализируя эмбрионы 3-6-го дня, оценивали соотношение полов (доля мужчин) при зачатии в 0,5. При этом авторами выявлено, что соотношение полов аномальных эмбрионов является мужским, в то время как эмбрионов с нормальным кариотипом, преимущественно, женскими. Таким образом, ПСП у человека, по всей видимости, отклоняется от пропорции 1:1 в сторону избытка зигот мужского пола, и оно, видимо, больше, чем ВСП. Подтверждают эти выводы и другие авторы [7]. Авторы связывают избыток плодов мужского пола на момент зачатия с уровнем гормонов обоих родителей. Отмечено, что, если условия во время беременности являются стрессовыми, то «хрупкие» плоды мужского пола будут чаще отбраковываться, при мужских эмбрионах чаще происходят выкидыши, хотя большее число самцов доживает до рождения.

Вспомогательные репродуктивные технологии (ВРТ) становятся все более доступными в системе оказания помощи бесплодным парам. По данным отечественных и зарубежных авторов ежегодно все большему количеству супружеских пар необходимо применение методов ВРТ по всему миру, в том числе, и в России [8].

Однако, при проведении ВРТ существует определенный риск изменения соотношения полов при рождении, что может быть связано с особенностями технологий и определенным «искусственным отбором», селекцией по полу при проведении предимплантационной генетической диагностики (ПГД), что запрещено в большинстве стран [9][10].

Исследование Zhao J. и соавт. (2023) [11] показало сложные взаимосвязи ВСП плода с факторами, вызывающими бесплодие и технологиями ВРТ. Подтверждается сложное взаимодействие различных факторов при ВРТ, подчеркивая важность учета типа бесплодия, возраста отца, метода оплодотворения, стадии переноса эмбриона и длительности использования гормонов при оценке ВСП. Так, например, технология ИКСИ повышает соотношение полов в сторону мужского, а использование криотехнологий, напротив, снижает. Авторы отмечают, что для подтверждения и расширения результатов данного исследования необходимы дальнейшие работы с большой выборкой.

В мире накоплены уже значительные данные по перинатальным исходам ВРТ, в том числе, опубликованы крупные международные обзоры, изучающие соотношение полов при проведении технологий ВРТ. Так, ретроспективное исследование 7410 детей, зачатых в результате ВРТ в Китае (2001-2015 г), свидетельствуют о том, что доля мужского пола превалирует (от 51,4 до 53,3%) в зависимости от протокола ВРТ [12].

В крупном обзоре 2014 года [13] авторами указано, что соотношение полов, как при оплодотворении, так и при имплантации оценивается большинством исследователей, как 1,29 и 1,50 в циклах ЭКО и 1,07 в циклах ИКСИ. Данные цифры обозначают отношение плодов мужского пола к плодам женского пола. Они отражают более значимое, чем в большинстве стран, превалирование плодов мужского пола. При этом установлено, что первичное соотношение полов плода ниже вторичного: так в циклах ЭКО данная величина соответствует 1,03 после дробления и 1,25 на стадии бластоцисты. При ИКСИ данный показатель значимо ниже: 0,95 после дробления и 1,04 на стадии бластоцисты. Это связывают с установленным фактом преждевременной инактивации Х-хромосом при дроблении in vitro. Вместе с этим отмечено ИКСИ-индуцированное уменьшение количества клеток трофэктодермы в женских бластоцистах, которое может объяснять преимущественную гибель эмбрионов женского пола на ранних стадиях после имплантации и, таким образом, вариации соотношения полов при рождении в циклах ВРТ.

Заслуживает внимания серьезное по объему выборки исследование, проведенное в Австралии и Новой Зеландии [14]. В исследование были включены 13 368 младенцев от 13 165 женщин, которым был перенесен один эмбрион при проведении ВРТ . Соотношение полов при рождении составило 51,3% плодов мужского пола к 48,7% женского пола. Было больше новорожденных мужского пола, родившихся после ЭКО (53.0%), чем при ИКСИ (50.0%). Отмечено, что соотношение полов зависело и от стадии переноса эмбриона, также в пользу мужского пола при переносе эмбриона в стадию бластоцисты (54,1%), тогда как в стадию расщепления 49,9%. При этом установлено, что при переносе бластоцист при ЭКО родилось 56,1% мужского пола, а при ИКСИ младенцев мужского пола родилось значимо меньше (48,7%).По результатам данного исследования были сделаны выводы, что изменение соотношения полов при рождении детей связано с технологией ВРТ. Механизм этих эффектов остается неясным. При этом отмечено, что клиники и пациенты должны быть осведомлены о смещении в соотношении полов при рождении при использовании процедур ВРТ.

Еще одно мультицентровое исследование, опубликованное в 2016 году [15], отражает соотношение полов в когорте из 14,996 детей, рожденных после ЭКО, и когорте из 12,164 детей, рожденных после ИКСИ с использованием сперматозоидов из эякулята, а также 646 детей, рожденных после ИКСИ из неэякулированной спермы. Соотношение полов, зачатых с помощью ЭКО, составило 53,1% в пользу младенцев мужского пола (95% Ди: 52.3-53.9); соотношение полов от ИКСИ с эякулированной и неэякулированной спермой показало статистически значимое снижение доли младенцев мужского пола (48.2%; 95% ДИ: 47.3-49.1 и 47,7%; 95% ДИ: 43.8-51.6, соответственно). Таким образом, показано, что разные режимы ИКСИ (использование сперматозоидов из эякулята по сравнению с неэякулированной спермой) также меняют соотношение полов. Подтверждено, что при ЭКО более низкая подвижность сперматозоидов, в том числе астенозооспермия (подвижность сперматозоидов <40%), ассоциировалась со статистически значимо более низким соотношением полов по сравнению с нормальной спермой (51,0%; 95% ДИ: 48,6-53,3 против 53,4%; 95% ДИ: 52,5-54,3). В ИКСИ с эякулированной спермой не было связи между подвижностью сперматозоидов и соотношением полов. Концентрация сперматозоидов не была связана с соотношением полов как при ЭКО, так и при ИКСИ.

Влияние витрификации на ПСП, как одного из серьезных стрессовых факторов, подтверждается и в экспериментальных работах [16]. В работах Angela D’Alfonso и соавторов (2023) [17] показано, что эмбрионы мужского и женского пола по-разному реагируют на стресс, и эмбрионы мужского пола проявляют меньшую сопротивляемость. Это явление, по-видимому, сохраняется в течение примерно шести месяцев после стрессового события, что указывает на необходимость регулирования репродуктивной функции и защиты продолжения рода. Хотя связь зависимости с родительскими решениями, благодаря пренатальной диагностике и методам искусственного оплодотворения, легко понять, гораздо сложнее соотнести ее вариации с давлением окружающей среды, которое действует через вторичные механизмы. Пандемия Covid-19 [18], стихийные бедствия, террористические атаки, экономические кризисы — вот некоторые из стрессогенных событий, с которыми мы столкнулись в последнее время. Авторы считают, что влияние всех перечисленных факторов объясняется не только возможным априорным определением пола при зачатии, но и вторичными эффектами на исход беременности. Таким образом, соотношение полов при рождении, по-видимому, является сложным и многофакторным механизмом, не всегда зависящим от генетики.

Однако, в свете этого многие вопросы до конца еще не решены: дискуссионным является вопрос о том, есть ли различия гендерного соотношения при исходном бесплодии в браке в зависимости от способа зачатия: спонтанное зачатие или применение различных технологий ВРТ, а также о гендерных различиях при технологии ЭКО в сравнении с ИКСИ в популяции Российских женщин. Это и определило актуальность настоящего исследования

Цель исследования: определить соотношение полов плода при беременности, наступившей в результате использования вспомогательных репродуктивных технологий (ВРТ) в сравнении с естественным зачатием у супружеских пар с бесплодием.

Материалы и методы

Проведено ретроспективное когортное исследование. Основную группу составили 1177 пациенток с беременностью, наступившей в результате ВРТ, из них 862 с одноплодной и 320 с многоплодной беременностью. Данные были взяты из регистра родов пациенток после ВРТ, произошедших в ФГБУ НИИ ОММ за 5 лет наблюдения, набор материала осуществлялся сплошным методом. Поскольку ФГБУ НИИ ОММ является Федеральным перинатальным центром 3Б уровня, в центре родоразрешались пациентки, у которых ВРТ проводилось в 8-ми разных клиниках (ФГБУ НИИ ОММ (большинство пациенток), «Центр семейной медицины», КДЦ, ОМСК, Санкт-Петербург, Москва, УФА, Тюмень).

Контрольную группу составили 376 пациенток с бесплодием, у которых беременность наступила спонтанно, без применения технологий ВРТ (356 с одноплодной и 20 с многоплодной беременностью). Данные взяты из информационной базы ФГБУ НИИ ОММ случайным методом с помощью генератора случайных чисел. Беременность у пациенток основной и контрольной группы вынашивалась в один и тот же период, что позволило нивелировать влияние на гендерные различия социальных факторов. Проведен анализ соотношения полов плода при различных технологиях ВРТ (ЭКО и ИКСИ). ИКСИ проводили при бесплодии вследствие мужского фактора или у пациенток с неудачными попытками ЭКО в анамнезе. Дополнительно проанализированы гендерные особенности при неразвивающейся беременности у 557 пациенток (462 при спонтанной беременности и 95 после беременности в результате ВРТ) с нормальным и аномальным кариотипом плода. Исследование было одобрено комитетом ФГБУ НИИ ОММ по этике (протокол № 12 от 07.07.2019 г.).

Статистический анализ данных осуществлялся с помощью пакета прикладных программ Statistica 7.0. Различия между непараметрическими переменными проводилось при помощи χ² Пирсона (Person). Нулевая гипотеза отвергалась при р<0,05.

Результаты и обсуждение

В процессе анализа основная группа пациенток была разделена на подгруппы в зависимости от метода проведения ВРТ: ЭКО и ИКСИ, в каждой из подгрупп были выделены подгруппы с одноплодной беременностью и многоплодием.

Как видно из таблицы 1, в группах пациенток с бесплодием, преодоленным с применением ВРТ, по сравнению группой исходно бесплодных пациенток с естественным зачатием значимо выше доля многоплодия (в 5 раз выше в подгруппе ЭКО и в 4,5 раза выше в подгруппе ИКСИ). Это связано как с переносом двух и более эмбрионов (бихориальный тип плацентации), так и с многоплодием, возникшим спонтанно, при делении перенесенного единственного эмбриона (монохориальный тип плацентации при беременности двойней, тройней и единственной в нашем регистре четверней). Это значимо увеличивает риск прерывания беременности в экстремально недоношенном сроке вследствие формирования истмико-цервикальной недостаточности [19]. Для оценки структуры групп были изучены возраст, паритет, характер бесплодия.

Средний возраст пациенток основной группы (подгруппа ЭКО) составил 33,85(4,11) лет, подгруппа ЭКО+ИКСИ 33,06(4,62) лет, контрольной — 32,85(4,54) года. Следует отметить, что в подгруппе ЭКО основной группы пациенток моложе 30 лет было всего 15,8%, тогда как в остальных группах — 23,9 -23,5%. При этом в подгруппе ИКСИ было более 10% в возрасте 40 лет и более (наибольший возраст 52 года), тогда как в подгруппе ЭКО таковых было 8%, а в контроле 6,5%. По остальным возрастным группам особых отличий не получено. При анализе паритета установлено, что в подгруппе ЭКО и контрольной группе доля первобеременных была примерно одинакова (39,9 и 39,6%), тогда как в подгруппе ИКСИ доля первобеременных составила около половины (48,3%). В контрольной группе доля повторнородящих была наибольшая — 37,9%.

Треть женщин основных групп имели отягощенный абортами, самопроизвольными выкидышами, неразвивающимися беременностями акушерский анамнез. Первичное бесплодие соответственно выявлено в подгруппе ЭКО и контрольной группе в 60%, в подгруппе ИКСИ — в 51%. Остальные пациентки имели вторичное бесплодие. По соматической и гинекологической заболеваемости группы сопоставимы.

Как видно из таблицы 3, при одноплодной беременности после проведения ВРТ, по нашим данным имеется тенденция к уменьшению числа младенцев мужского пола (48,3% при ЭКО и 49,2% при ИКСИ). Эти данные отличаются от данных Австралийского исследования, процитированных ранее [14]. Однако, статистически значимых различий отношения шансов родить плода мужского пола не выявлено: ОШ при сравнении группы ЭКО и спонтанной беременностью у пациенток с бесплодием 0,877при 95% ДИ 0,671-1,137; при сравнении группы ИКСИ и контрольной группы ОШ 0,907 при 95% ДИ 9,661-1,245; при сравнении групп ИКСИ и ЭКО ОШ 1,039 при 95% ДИ 0,779-1,386. Соотношение полов у женщин с одноплодной беременностью и бесплодием в анамнезе, преодоленным без применения технологий ВРТ, близко к популяционному: в России 1,07 (контрольная группа) против 1,06 (Российский показатель) [2].

Однако, следует отметить, что приведенная в демографических справочниках популяционная величина этого показателя не учитывает, одноплодная беременность или многоплодная. Поэтому, заслуживает отдельного изучения характер соотношения плодов при многоплодной беременности у пациенток с бесплодием в зависимости от метода его преодоления. Работы по этой проблеме немногочисленны. В частности, проводилось исследование монозиготных близнецов после ВРТ, включающее только 38 пар. Данное исследование показало, что после ЭКО преобладает мужской пол плода в соотношении 2,2, тогда как при ИКСИ достоверно преобладал женский пол плодов (69% младенцев женского пола против 31% младенцев мужского пола) [20]. В исследовании ChenM. и соавторов (2017 г) [12] подтверждено, что коэффициент вторичного пола при одноплодной беременности выше, чем при многоплодии. Наименьшим он был при ИКСИ и криопереносах.

Как видно из таблицы 4, при многоплодной беременности, наступившей в результате ЭКО, имеется тенденция к увеличению доли плодов мужского пола. В этой группе зарегистрировано 82 двойни, две тройни даже одна четверня, в которых все плоды были мужского пола. Однако, статистически значимых различий шансов родить младенцев мужского пола не выявлено.

В подгруппе пациенток, у которых беременность наступила в результате применения технологии ИКСИ, а также в подгруппе с естественным зачатием доля плодов мужского пола значимо ниже — превалируют плоды женского пола (53% и 55,1%). Это подтверждает отмеченные большинством исследователей закономерности, что в результате ИКСИ доля плодов женского пола выше, чем при ЭКО.

Таким образом, у женщин с одноплодной беременностью в результате различных технологий ВРТ имеется тенденция к изменению гендерного соотношения в сторону плодов женского пола (соотношение полов 0,93), в отличие от пациенток с бесплодием, преодоленным без применения ВРТ (соотношение полов 1,07). При многоплодной беременности в результате ЭКО соотношение полов плода изменено в сторону мужского пола (соотношение полов 1,21), в отличие от пациенток с естественным зачатием при бесплодии (соотношение полов 0,81) и пациенток, забеременевших с применением технологии ИКСИ (соотношение полов 0,88).

Общий результирующий показатель соотношения полов плода при ЭКО (1,05) и бесплодии, преодоленном естественным путем (1,04), близок к общепопуляционному показателю для России (1,06) [2]. Однако, при беременности, наступившей в результате ИКСИ, сохраняется тенденция к превалированию плодов женского пола, как при одноплодной, так и при многоплодной беременности. Общий результирующий показатель — 0,93. Это может быть связано с отсутствием контакта сперматозоида, несущего Х хромосому, с зоной pellusida, что повышает его жизнеспособность.

Однако, возможно, вторичное соотношение полов ниже популяционного связано с повышенной гибелью эмбрионов определенного пола? Для уточнения этого факта мы изучили соотношение полов при неразвивающейся беременности, при которой было проведено цитогенетическое исследование абортивного материала. В данную часть исследования включены все неразвивающиеся беременности, прерванные в ФГБУ НИИ ОММ в течение последних 10 лет, у которых удалось исследовать кариотип плода.

Учитывая, что при приготовлении препаратов хромосом, на величину соотношения полов может оказывать влияние такой артефакт, как контаминация культур эмбриональных тканей материнскими клетками, ворсины хориона обрабатывали по стандартизированному протоколу ускоренного «прямого» метода приготовления препаратов, которые окрашивали унифицированным дифференциальным методом G-окраски с применением 0,25% раствора трипсина и раствора красителя Гимза.

При неразвивающейся беременности, наступившей в результате ЭКО, при нормальном кариотипе плода, соотношение полов соответствует популяционному, характерному для России. В отличие от этого, все эмбрионы с нормальным кариотипом, зачатые с помощью технологии ИКСИ, погибшие в первом триместре, имели мужской пол, что отчасти объясняет вышеприведенные данные по тенденции к превалированию плодов женского пола при прогрессировании беременности, наступившей в результате ИКСИ. Очевидно, эмбрионы женского пола, зачатые при данной технологии, являются более жизнеспособными при наличии у них нормального кариотипа. При спонтанной беременности у эмбрионов с нормальным кариотипом, прекративших свое развитие в первом триместре, выявлялся преимущественно женский пол.

Полученные данные согласуются с исследованиями других авторов, отмечающих преобладание эмбрионов женского пола среди спонтанных абортусов с нормальным кариотипом [21]. В работе Толмачевой Е.Н., Васильева С.А., Саженова Е.А. с соавт., 2015 [22] показано, что соотношение полов в первом триместре беременности сдвинуто в сторону мужского за счет повышенной элиминации эмбрионов женского пола. Авторы объясняют данное явление нарушением процессов инактивации Х-хромосомы, связанной с компартментализацией клеток в бластоцисте и перераспределением клеточной массы с активной Х-хромосомой, несущей аберрации, несовместимые с нормальным эмбриональным развитием. При анализе соотношения полов в нашем исследовании при выявлении аномального кариотипа соотношение во всех группах было смещено в сторону женского пола (Таблица 6, рисунок 2), что подтверждает данные других авторов [18][19].

Таким образом, при цитогенетическом исследовании тканей эмбрионов при неразвивающейся беременности как спонтанно наступившей, так и после ВРТ, установлено, что при аномальном кариотипе эмбрионов соотношение мужского и женского пола близко к 1:1. Однако, после ИКСИ, выполненной в связи с выраженными нарушениями сперматогенеза, и нормальном кариотипе эмбриона, имеет место элиминация плодов только мужского пола. Однако, данных, накопленных нами о неразвивающейся беременности в результате ИКСИ, как при нормальном, так и при аномальном кариотипе, явно недостаточно для окончательных выводов. Небольшой размер выборки не обеспечил достаточной мощности для обнаружения статистически значимых различий, мы можем описывать только выявленные тенденции. Необходимы дальнейшие исследования этого вопроса.

При спонтанной беременности вне зависимости от кариотипа соотношение полов одинаковое, близкое к 1 и среднему популяционному. При беременности после использования ВРТ без использования технологии ИКСИ, при аномальном кариотипе соотношение полов не меняется, а при нормальном кариотипе плода сдвигается в сторону мальчиков (мальчиков больше). При использовании технологии ИКСИ в материале эмбрионов при неразвивающейся беременности определялись только мужские кариотипы (46,ХУ.

Заключение

Проведенные исследования показывают, что вторичное соотношение полов (у новорожденных) не имеет значимых различий в зависимости от способа наступления беременности (самопроизвольная или традиционное ЭКО). Однако, при индуцированной беременности с использованием ИКСИ имеет место тенденция к сдвигу соотношения в сторону женского пола.

При этом у абортусов с нормальным кариотипом, установленным при цитогенетическом исследовании клеток цитотрофобласта ворсинчатого хориона, выявлен в 100% мужской кариотип (46,ХУ), а при аномальном кариотипе тенденция к преобладанию эмбрионов женского пола.

Для более достоверной оценки генетического груза в популяции и различий в жизнеспособности организмов разного пола в различные периоды онтогенеза при индуцированной беременности с применением процедуры ИКСИ требуются дальнейшие исследования, в том числе, с использованием неинвазивных технологий определения пола на ранних этапах гестации.

Выводы

1. Установлено, что соотношение полов у новорожденных у супружеских пар с бесплодием, преодоленным естественным путем и после традиционного ЭКО близко к общепопуляционному показателю для России (1,06);

2 Анализ вторичного соотношения полов при беременности, наступившей в результате ИКСИ, показал тенденцию к превалированию плодов женского пола, как при одноплодной, так и при многоплодной беременности.

3. Полученные нами результаты цитогенетического исследования клеток цитотрофобласта при неразвивающейся беременности в первом триместре при нормальном кариотипе после ЭКО преобладали эмбриона мужского пола, после ИКСИ в 100% — мужского пола. При аномальном кариотипе во всех подгруппах с бесплодием (подгруппа ЭКО, подгруппа ИКСИ и группа с естественным зачатием) преобладали эмбрионы женского пола.