Роль факторов микроокружения преовуляторного ооцита в патогенезе «бедного» ответа яичников в программах экстракорпорального оплодотворения

Введение

«Бедный» ответ яичников (БОЯ) на контролируемую овариальную стимуляцию (КОС) в цикле ЭКО представляет собой одну из наиболее распространенных причин бесплодия — у трети пациенток, вступающих в программы ЭКО, диагностирован данный диагноз.

Факторами риска, способствующими истощению яичников и «бедному» их ответу на гормональную стимуляцию, являются поздний репродуктивный возраст, ожирение, оперативные вмешательства на органах малого таза, эндометриоз, наличие аутоиммунных и системных заболеваний, химиотерапия, генетическая предрасположенность.

В числе прочих факторов, способных оказывать влияние на результаты программ ВРТ, находится микроокружение созревающего ооцита. За последнее десятилетие опубликованы результаты исследований, демонстрирующие роль биохимического профиля фолликулярной жидкости (ФЖ) в процессах роста и созревания ооцитов. Большинство работ констатирует связь неоптимального ответа на стимуляцию суперовуляции в программах ВРТ с нарушением гормонального профиля фолликулярной жидкости [1-3]. Некоторые авторы подчеркивают наличие связи «бедного» ответа яичников и оксидативного стресса, нарушения процессов апоптоза клеток тканевого микроокружения, изменения содержания регуляторов сосудистого тонуса и ангиогенеза [4-6].

Причины отсутствия ооцит-кумулюсного комплекса (ОКК) в преовуляторном фолликуле также остаются до конца не изученными. Ряд авторов отмечает наличие связи между микроокружением ооцита, в том числе факторов, регулирующих сосудистый тонус и процессы ангиогенеза [7-8], и наличием ОКК. Кроме того, известно, что оксид азота в небольших объемах выполняет функции вазодилататора, в то время как его повышенный уровень ассоциирован с нитрооксидативным стрессом и ненаступлением беременности [8-9].

Таким образом, изучение факторов, способствующих процессам васкуляризации и ангиогенеза в растущем фолликуле, а также оценка биохимических показателей, отражающих уровень оксидативного стресса, и их влияние на ответ яичников при КОС, является актуальным направлением для исследования.

Цель исследования. Оценить содержание биохимических факторов и регуляторов сосудистого тонуса и ангиогенеза в фолликулярной жидкости у пациенток с «бедным» ответом яичников на стимуляцию в программах ЭКО в сравнении с аналогичными показателями у женщин, характеризующихся нормальным овариальным ответом.

Материалы и методы

Проведено открытое проспективное когортное сравнительное исследование, в котором приняли участие 56 пациенток, включенных в программу ЭКО. Критерием когортного разделения женщин являлся ответ яичников на контролируемую стимуляцию овуляции в рамках цикла ЭКО. Пациентки с «бедным» ответом яичников (n=32) были отнесены к основной группе, с нормальным ответом яичников (n=24) — к группе сравнения.

Был проведен анализ биохимических и растворимых регуляторных факторов фолликулярной жидкости пациенток с «бедным» ответом яичников и с нормальным ответом яичников. Забор и анализ фолликулярной жидкости осуществлялись в день трансвагинальной пункции после завершения контролируемой овариальной стимуляции.

С целью определения влияния микроокружения на формирование и рост фолликула, образцы ФЖ пациенток из основной группы были разделены на две подгруппы в зависимости от наличия ооцит-кумулюсного комплекса внутри фолликула: 1 подгруппа — фолликул без ОКК; 2 подгруппа — фолликул с ОКК. В фолликулярной жидкости пациенток из группы сравнения ОКК присутствовал во всех образцах (3 подгруппа).

Статистический анализ данных проводился с использованием методов вариационной статистики. В случае нормального распределения признака данные представляли в виде средней величины (М) и среднеквадратичного отклонения (sd). В случае, когда распределение признака отличалось от нормального, данные представляли в виде медианы (Ме) и нижнего и верхнего квартилей (25-го и 75-го процентилей). Критический уровень значимости различий: p ≤0,05

Результат

Группы были сопоставимы практически по всем анамнестическим данным, за исключением уровня антимюллерова гормона (уровень в основной группе был в 3 раза ниже, чем в группе сравнения, p<0,001) и преобладания заболевания шейки матки (p=0,02) и неразвивающейся беременности в анамнезе (p<0,001) в анамнезе у пациенток основной группы.

Анализ биохимического профиля ФЖ пациенток исследуемых групп позволил выявить ряд статистически значимых отличий в уровне ряда показателей, в том числе уровня антиоксидантной активности (таблица 1).

В результате оценки факторов, регулирующих процессы ангиогенеза, выявлены статистически значимые различия между содержанием VEGF-A и sVEGFR-2 в образцах ФЖ без ОКК (1-й подгруппы) и ФЖ с ОКК группы сравнения (3-й подгруппы). Полученные результаты приведены в таблице 2.

Обсуждение

Уровень мочевины в ФЖ среди пациенток с «бедным» ответом яичников (подгруппы 1, 2) был статистически значимо выше, чем у пациенток с нормальным ответом яичников (p_1-3=0,029; p_2-3=0,046). Мочевина как продукт белкового катаболизма, за счет высвобождения активных форм кислорода и окислительной стимуляции, способна оказывать токсический эффект на процессы созревания ооцитов и формирования эмбрионов, а также способствовать развитию окислительного стресса.

При оценке содержания общего билирубина в ФЖ пациенток исследуемых групп выявлена следующая тенденция: в подгруппах «бедного» ответа яичников наблюдаются меньшие значения общего билирубина по сравнению с 3 подгруппой (p_1-3=0,032; p_2-3=0,006). Принимая во внимание антиоксидантную роль билирубина, можно предположить, что его повышенный расход связан с уровнем антиоксидантной активности, направленной на снижение окислительных процессов в фолликуле.

Уровень глюкозы в ФЖ пациенток подгруппы 1 оказался статистически значимо выше, чем аналогичный показатель в подгруппе 3
(p_1-3=0,036). При этом показатели в подгруппах 2 и 3 практически не отличались (p_2-3=0,59). Можно предположить, что расход глюкозы и, как следствие, меньшие концентрации глюкозы в ФЖ, содержащей ооцит, были связаны с ее интенсивным использованием при росте фолликулов.

Уровень лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в ФЖ пациенток с «бедным» ответом (2 подгруппа) оказался ниже, чем в группе сравнения (p_2-3=0,016), что, вероятно, объясняется сокращением активности ЛДГ при снижении овариального резерва. Более низкий уровень ЛДГ в ФЖ пациенток с «бедным» ответом яичников может указывать на процессы аэробного гликолиза, связанные с высоким содержанием активных форм кислорода. Таким образом, можно допустить, что ЛДГ является косвенным признаком окислительного стресса.

К числу индикаторов окислительного стресса, помимо описанных выше, относятся также липидный профиль и общий антиоксидантный статус (TAOS), который является наиболее универсальным показателем антиоксидантной активности системы.

В ходе анализа полученных значений растворимых биохимических факторов в фолликулярной жидкости выявлено, что в образцах ФЖ без ОКК уровень липопротеидов высокой плотности (ЛПВП) был статистически значимо выше, чем в ФЖ с ОКК в группе сравнения (p_1-3 =0,029). Учитывая то, что ЛПВП выполняют до 80% антиокислительных функций в фолликулярной жидкости, допустимо предположить, что повышение концентрации ЛПВП является отрицательным предиктором нормального созревания ооцитов, отражая неблагоприятные условия в растущем фолликуле, стимулирующие антиоксидантную активность.

Показатель TAOS в ФЖ пациенток 1-й подгруппы оказался выше, чем у пациенток 3-й подгруппы (p_1-3=0,017). Повышенный уровень антиоксидантной активности может быть связан с окислительным стрессом в фолликулах пациенток с «бедным» овариальным ответом и, как следствие, ухудшением качества ооцитов или их нежизнеспособностью.

Увеличение антиоксидантной активности ФЖ, по всей видимости, связано со снижением вероятности успешного исхода оплодотворения и может отражать потребность ооцита в повышенной защите в неблагоприятных условиях развития, представляя собой часть функционирующего защитного механизма. В то же время у пациенток с нормальным ответом яичников адекватное потребление антиоксидантов, обусловленное оптимальным количеством растущих фолликулов, демонстрирует снижение уровня TAOS.

Усиление антиоксидантной активности может происходить в ответ на повышение уровня мочевой кислоты в ФЖ для компенсации окислительного стресса, вызванного повышенной продукцией свободных радикалов. Однонаправленное изменение уровней мочевой кислоты и антиоксидантной активности может свидетельствовать об адаптационных механизмах организма для сокращения воздействия окислительного стресса. При этом уровень билирубина может сокращаться в связи с его способностью к активной нейтрализации реактивных азотистых соединений.

Остальные показатели биохимического обмена фолликулярной жидкости, проанализированные в рамках исследования, статистически значимо не отличались среди всех рассматриваемых групп.

Окислительный стресс индуцирует действие регуляторов ангиогенеза и сосудистого тонуса, которые оказывают влияние на васкуляризацию растущих фолликулов [10]. Анализ содержания растворимых регуляторов ангиогенеза и сосудистого тонуса позволил выявить различия между образцами ФЖ пациенток с «бедным» и нормальным ответом яичников.

Так, уровень VEGF-A в фолликулярной жидкости 1-й подгруппы был статистически значимо ниже, чем аналогичный показатель в группе сравнения (p_1-3= 0,02). Известно, что васкулоэндотелиальный фактор роста способствует запуску процессов ангиогенеза. Таким образом, отсутствие в ФЖ пациенток с «бедным» ответом ооцит-кумулюсного комплекса ассоциируется со сниженным содержанием VEGF-A, стимулирующим формирование сосудистой сети и полноценное питание фолликула.

Концентрация sVEGFR-2 в образцах ФЖ без ОКК (1-й подгруппы) также была существенно ниже аналогичного показателя в группе сравнения (p_1-3= 0,04), что очевидно коррелирует со снижением содержания VEGF-A.

Сравнение концентраций VEGF-A и sVEGFR-2 в образцах фолликулярной жидкости, содержащей ооцит-кумулюсный комплекс (подгруппы 2 и 3), не показало статистически значимых отличий.

Поддержание функции фолликула требует повышенной васкуляризации тека-клеток, которая существенным образом зависит от состояния сосудистого русла. В ходе оценки регуляторов сосудистого тонуса выявлено, что уровень NO₃ и общего NO₂ в ФЖ пациенток всех исследуемых групп и подгрупп практически не отличается. Однако обнаружено статистически значимое повышение концентрации эндогенного NO₂ в образцах фолликулярной жидкости без ооцита по сравнению с аналогичным показателем в группе сравнения (p_1-3= =0,049).

Повышение продукции эндогенного NO₂ в образцах ФЖ без ОКК может свидетельствовать о готовности сосудов к ангиогенезу, необходимому для полноценного роста фолликула, однако недостаточная выработка ведущих факторов васкуляризации, очевидно, препятствует развитию сосудистой сети, что нарушает перифолликулярное кровоснабжение и ограничивает поступление необходимых веществ для формирования качественного ОКК. Кроме того, высокий уровень эндогенного NO₂ в фолликулярной жидкости является индикатором усиления нитрооксидативного стресса.

Концентрации оксидов азота в образцах ФЖ пациенток с «бедным» ответом, содержащих ОКК, практически не отличались от аналогичных показателей в группе с нормальным ответом на стимуляцию. На этом основании можно предположить, что отсутствие ОКК в зрелом преовуляторном фолликуле пациенток с БОЯ является, в том числе, следствием нарушения процессов его васкуляризации.

Заключение

Таким образом, у пациенток с «бедным» ответом яичников имеет место повышение уровня мочевой кислоты и снижение содержания общего билирубина в фолликулярной жидкости, что свидетельствует о признаках оксидативного стресса. Маркерами нарушения созревания ооцита у пациенток с «бедным» ответом яичников являются также повышенное содержание глюкозы, ЛПВП и увеличение общей антиоксидантной емкости фолликулярной жидкости.

Отсутствие ооцит-кумулюсного комплекса в преовуляторном фолликуле ассоциируется с нарушением процессов васкуляризации, установленным на основании снижения про- и противоангиогенных факторов (VEGF-А и sVEGFR-2) в фолликулярной жидкости.