Влияние раствора хлоргексидина биглюконата на сохранность бактериальной ДНК и эффективность ПЦР

Введение

Хлоргексидина биглюконат (ХБ) является одним из самых используемых антисептиков. ХБ обладает доказанной активностью в отношении грамположительных и грамотрицательных бактерий [1]. Механизм действия заключается в разрушении клеточной стенки, что приводит к осмотическому шоку и гибели микроорганизмов [2]. Как правило, для обработки кожи и слизистых оболочек используются 0,05% раствор ХБ.

При этом в части инструкций к наборам реагентов для полимеразной цепной реакции (ПЦР) ХБ упоминается как интерферирующее вещество, способное оказывать воздействие на результаты ПЦР [3]. ХБ ингибирует РНК-зависимую РНК-полимеразу, связываясь с активным центром фермента [4], что не исключеет вероятности ингибирования других ферментов синтеза нуклеиновых кислот, включая Taq-полимеразу. Кроме того, было отмечено, что ХБ разрушает ДНК лейкоцитов [5], что заставляет рассматривать гипотетическую возможность разрушения микробной ДНК под воздействием ХГ. По этой причине у врачей часто возникает вопрос относительно достоверности результатов ПЦР-исследования, если пациент перед сдачей биоматериала обрабатывал слизистую ХБ, в том числе слизистую носоглотки при сдаче на респираторные инфекции и слизистую урогенитального тракта при исследовании на микробиоту и инфекции, передаваемые половым путем.

Цель исследования — оценить влияние раствора хлоргексидина биглюконата на сохранность бактериальной ДНК и эффективность ПЦР.

Материалы и методы

Для оценки влияния ХБ на сохранность бактериальной ДНК и эффективность ПЦР готовили 7 серий пробирок: по 3 пробирки с 900 мкл 0,05% ХБ и 1 контрольной пробирке с 900 мкл физиологического раствора (всего 28 пробирок — 21 с ХБ и 7 контрольных). Во все пробирки вносили по 100 мкл. смеси бактериальных культур Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus aureus и Escherichia coli (плотность каждой культуры 0,5 по Макфарленду) (Рисунок 1).

Из первой серии пробирок провели выделение ДНК сразу после приготовления суспензий, 3 серии пробирок поместили в холодильник (+4 °C) и 3 — в морозильную камеру (-20 °C). Через 1, 2 и 7 суток хранения изымали по одной серии пробирок из холодильника и морозильной камеры и проводили выделение ДНК.

Выделение ДНК осуществляли набором Проба-НК-ПЛЮС (ООО ДНК-Технология, Россия). Выделенную ДНК исследовали набором для ПЦР-диагностики “Андрофлор” (ООО ДНК-Технология, Россия). Полученные результаты по Lactobacillus spp, Staphylococcus spp и группе Enterobacteriaceae/Enterococcus (группа EE) сравнивали в экспериментальных и контрольных образцах, рассчитывая отклонение каждого показателя в экспериментальных образцах от аналогичного показателя в контрольном образце серии по следующей формуле:

Δ = 2^{CpБХ – CpХ},

где Δ — отклонение показателя в эксперименте с ХБ от показателя в контроле, показывает во сколько раз количество целевой группы отличается в эксперименте от контроля при максимальной эффективности ПЦР; CpБХ — индикаторный цикл амплификации для целевой группы бактерий в контрольном образце без ХБ; CpХ — индикаторный цикл амплификации для целевой группы бактерий в экспериментальном образце с ХБ.

Результат представляли как медиану по 3 экспериментальным пробиркам серии со значениями 1-го и 3-го квартилей.

Статистическую обработку и визуализацию данных проводили с помощью R версии 4.4.3. В качестве меры центральной тенденции при описании переменных указывали медиану со значениями 1-го и 3-го квартилей.

Результаты

В случае выделения ДНК непосредственно после приготовления образцов получали сопоставимые результаты в пробах с ХБ и без ХБ по показателям Lactobacillus spp и Staphylococcus spp, тогда как количества бактерий группы EE были на 0.3 (0.2; 0.4) lg выше в образцах с ХБ (Рисунок 2).

В образцах, хранившихся в холодильнике (+4 °C), вне зависимости от времени хранения и группы бактерий не отмечали ингибирующего эффекта ХБ на ПЦР. Изменение лактобацилл в экспериментальных образцах составили 0.2 (0.2; 0.2) lg — через сутки, 0.5 (0.4; 0.6) lg — через двое суток и 0 (0; 0) lg — через 7 суток. Количество стафилококков изменилось на 0.1 (0; 0.1) lg — через сутки, на 0.3 (0.2; 0.3) lg — через двое суток и на 0.2 (0.2; 0.3) lg — через 7 суток. Изменения количества группы EE составили 0.3 (0.3; 0.3) lg — через сутки, 0.1 (0; 0.4) lg — через двое суток и 0.3 (0.2; 0.7) lg — через 7 суток.

В хранившихся в морозильнике экспериментальных образцах (-20 °C) количество лактобацилл изменялось на 0 (-0.1; 0) lg — через сутки, на -0.1 (-0.3; 0) lg — через двое суток и на 0 (0; 0) lg — через 7 суток. Количество стафилококков изменилось на 0 (0; 0.1) lg — через сутки, на 0.4 (0.1; 0.4) lg — через двое суток и на 0.3 (0.2; 0.3) lg — через 7 суток. Изменения количества группы EE составили 0.2 (0.2; 0.3) lg — через сутки, 0.5 (0.3; 0.5) lg — через двое суток и 0.5 (0.5; 0.5) lg — через 7 суток.

Обсуждение

ХБ не оказывал ингибирующего влияния на результаты ПЦР при исследовании на грамположительные и грамотрицательные бактерии. Выделение ДНК преципитационным методом как сразу после приготовления бактериальных суспензий в ХБ, так и через 1-7 дней хранения не приводило к снижению эффективности ПЦР в опытных образцах. Результаты проведенного эксперимента позволяют предположить, что ХБ не оказывает влияния на Taq-полимеразу, либо используемые в протоколе выделения отмывки позволяют полностью избавиться от интерферирующей концентрации ХБ. По всей видимости, ХБ в концентрации 0,05% не оказывает разрушающего эффекта на бактериальную ДНК, так как концентрации целевой бактериальной ДНК при хранении в ХБ даже несколько превышали аналогичные концентрации для контрольных образцов без ХБ.

Заключение

7-суточная экспозиция Lactobacillus acidophilus, Staphylococcus aureus и Escherichia coli в 0,05% растворе хлоргексидина биглюконата, как при температуре +4 °C так и -20 °C, не приводила к снижению выхода ДНК и не ингибировала ПЦР в случае выделения ДНК преципитационным методом. Данное наблюдение позволяет интерпретировать результаты ПЦР-исследований на бактериальные инфекции и состав микробиоты даже в случае предварительной обработки слизистой 0,05% раствором хлоргексидина биглюконата.

ДЕКЛАРАЦИЯ О НАЛИЧИИ ДАННЫХ: данные, подтверждающие выводы настоящего исследования, можно получить у контактного автора по обоснованному запросу. Данные и статистические методы, представленные в статье, прошли статистическое рецензирование.

СООТВЕТСТВИЕ ПРИНЦИПАМ ЭТИКИ: проведенное исследование соответствует стандартам Хельсинкской декларации (Declaration Helsinki), одобрено Комитетом по этике Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего образования «Уральский государственный медицинский университет» Минздрава России (ул. Репина, д. 3, г. Екатеринбург, 620028, Россия) протокол № 4 от 26.05.2023.

ВКЛАД АВТОРОВ:

Е.С. Ворошилина, Д.Л. Зорников, П.Г. Аминева — разработка концепции и дизайна исследования; Д.М. Нечаева, В.М. Симарзина, Д.О. Корнилов, А.Е. Карякина — проведение исследования; Д.Л. Зорников, Д.М. Нечаева, В.М. Симарзина, А.Е. Карякина — анализ и интерпретация результатов, обзор литературы, статистическая обработка, составление черновика рукописи; Е.С. Ворошилина, Д.Л. Зорников, П.Г. Аминева — критический пересмотр черновика рукописи и формирование его окончательного варианта.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающее надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой части работы.

DATA AVAILABILITY STATEMENT: Data supporting the findings of this study are available from the corresponding author upon reasonable request. The data and statistical methods presented in the study have been statistically reviewed by the journal editor, a certified biostatistician.

COMPLIANCE WITH ETHICAL STANDARDS: The study complies with the standards of the Helsinki Declaration, approved by the Independent Committee for Ethics of Ural State Medical University of the Ministry of Health of Russian Federation (Repina St., 3, Ekaterinburg, 620028, Russia), protocol No. 4 from 26.05.2023.

AUTHOR CONTRIBUTIONS:

Ekaterina S. Voroshilina, Danila L. Zornikov, Polina G. Amineva — concept statement and contribution to the scientific layout, Diana M. Nechaeva, Veronika M. Simarzina, Daniil O. Kornilov, Anastasia E. Kariakina — conducting experiment; Danila L. Zornikov, Diana M. Nechaeva, Veronika M. Simarzina, Anastasia E. Kariakina — analysis and interpretation of the results, literature review, statistical analysis; Ekaterina S. Voroshilina, Danila L. Zornikov, Polina G. Amineva — drafting the manuscript and preparing; its final version; introduction of valuable intellectual content.

All authors approved the final version of the paper before publication and assume responsibility for all aspects of the work, which implies proper study and resolution of issues related to the accuracy and integrity of any part of the work.