Streptococcus agalactiae в неонатологии: стратегии обнаружения

Введение

Streptococcus agalactiae — единственный стрептококк группы B (СГВ) согласно классификации по группоспецифическому полисахариду клеточной стенки Ребекки Лэнсфилд [1], является комменсалом в желудочно-кишечном и мочеполовом трактах человека. В то же время СГВ способен вызывать оппортунистические инфекции, иногда с тяжелым течением, особенно у новорожденных, для которых является основной причиной заболеваемости и смертности [2]. Инфекции кровотока, вызванные штаммами S. agalactiae, встречаются относительно редко, составляя всего 1–2%. В зависимости от времени дебюта инфекцию, вызванную СГВ у новорожденных, принято классифицировать на вариант с ранним началом — возникает на первой неделе жизни, и с поздним началом — развивается после первой недели и вплоть до 3 месяцев жизни.

Отмечено, что вагинальная колонизация СГВ была определена как фактор риска развития неонатальных инфекций [2] и преждевременных родов [3]. Примерно 10-30% женщин колонизированы СГВ во время беременности. Колонизация является необходимым условием для развития раннего сепсиса, причем сепсис более вероятен у женщин с высокой степенью колонизации [3]. Бактерии перемещаются из влагалища через шейку матки в полость матки и проникают в ткани, окружающие плод. После того, как СГВ проник в амниотическую полость или вступил в контакт с плацентой, существует вероятность хориоамнионита, что часто приводит к преждевременным родами и мертворождению.

Перинатальный скрининг, нацеленный на выявление СГВ у беременных, значительно снизил СГВ-ассоциированные неонатальные инфекции. Профилактика инфекции СГВ включает активное выявление колонизированных беременных женщин с помощью посева или ПЦР вагинально-ректального мазка между 35 -й и 37-й неделями беременности и проведение интранальной антибиотикотерапии матерям с высоким риском передачи СГВ. Клинические испытания, проведенные с 1980-х годов, показали, что данный подход может эффективно предотвратить ранние неонатальные инфекции. Так частота таких инфекций в США достигала 5 случаев на 1000 живорождений до широкого распространения интранатальной профилактики и значительно снизилась после ее введения, причем эта тенденция сохраняется и в последующие годы (0,37/1000 живорождений в 2006 г. и 0,23/1000 живорождений в 2015 г.) [4]. Однако данный подход не позволил полностью устранить СГВ-ассоциированные неонатальные инфекции, что вероятно обусловлено рядом факторов, повышающих риск данной патологии, включая: патогенность штамма, факторы организма хозяина, влияние вагинального микробиома и микробиома кишечника, повышение устойчивости СГВ к антибиотикам, формирование биопленок, а также ложноотрицательные результаты скрининга. Колонизация СГВ и инфицирование целевых тканей требует способности этих бактерий прилипать и сохраняться на слизистых эпителиальных поверхностях. В этих условиях формирование бактериальных биопленок может способствовать выживанию и размножению микробов за счет повышения устойчивости к защитным реакциям организма хозяина. СГВ кодирует ряд факторов вирулентности, которые позволяют ему сохраняться в суровой вагинальной среде и избегать факторов иммунологической защиты (Таблица 1).

Предположение о развитии инвазивной неонатальной инфекции основывается главным образом на клинических признаках, однако эти проявления могут быть малозаметными и неспецифическими, а также встречаться при неинфекционных заболеваниях. Лабораторные параметры также обладают низкой специфичностью и могут быть изменены при других состояниях, таких как дистресс плода или гипоксия-ишемия. «Золотым стандартом» диагностики неонатального сепсиса является культуральное исследование крови (гемокультура), но данный тест может иметь пониженную чувствительность у новорожденных из-за множества факторов, например, наличие бактериемии с низкой бактериальной нагрузкой. Показано, что бактериемия <10 КОЕ/мл обнаруживается у 68% всех новорожденных с бактериемией, бактериемия <1 КОЕ/мл — у 23% новорожденных [6]. Также на результат посева крови влияет использование антибиотикопрофилактики во время родов или трудности со взятием необходимого объема крови, так как «безопасный» объем крови для посева составляет от 4 до 4,5% от общего объема крови пациента.

Задержки в выявлении и лечении неонатальных инфекций могут вызвать серьезные последствия и в некоторых случаях смерть новорожденного, с другой стороны, ненужное применение антибиотиков также имеет пагубные последствия, такие как изменение нормальной микробиоты новорожденного, развитие устойчивости к противомикробным препаратам, повышенный риск других инфекций, токсическое повреждение органов (ото-, кардио-, гепатотоксичность и др.). Длительная госпитализация новорожденных увеличивает затраты на здравоохранение, приводит к выполнению более инвазивных процедур и в некоторых случаях требует отделения новорожденного от матери, что может помешать началу грудного вскармливания с последующим риском для ребенка. Таким образом, важно постоянно совершенствовать диагностические подходы для быстрой и правильной идентификации новорожденных с инфекцией.

Цель исследования — проанализировать эффективность, результативность и время выдачи результатов бактериологического исследования при неонатальном сепсисе и менингите, вызванного Streptococcus agalactiae, для определения лучшей диагностической стратегии.

Материалы и методы

Проанализированы данные историй болезни 10 новорожденных, у которых Streptococcus agalactiae выделяли из крови. Пациенты находились в ОРИТ и ОПН с января по ноябрь 2024 году в ГБУЗ СО «Екатеринбургский клинический перинатальный центр» г. Екатеринбурга. Микробиологические (бактериологические и ПЦР исследования) проводились на базе лаборатории ООО «Кволити Мед».

Взятие биоматериала (крови, ликвора и др.) у новорожденных для исследования проводилось согласно стандартным операционным процедурам. Показанием к исследованию крови на стерильность и ликвора согласно протоколу ГБУЗ СО «ЕКПЦ» было наличие факторов риска, клинических симптомов, лабораторных данных и/или «сигнальных факторов» (например, симптомов шока, судороги и др.).

Кровь для посева забирали в педиатрические флаконы (BacT/ALERT PF Plus, BioMérieux, Франция). Флаконы c кровью после доставки в лабораторию инкубировали в анализаторах гемокультур BacT/ALERT 3D120 (BioMérieux, Франция). После сигнала прибора о росте микроорганизмов из флаконов отбиралось по 5 мл аликвоты в стерильные пробирки для ускоренной идентификации. Затем по 10 мкл аликвоты высевали на 5% кровяной агар (с бараньей кровью, обогащенный сывороткой и дрожжевым экстрактом), шоколадный агар. Посев ликвора также осуществляли на кровяной и шоколадный агары, а также обогащали 500 мкл пробы в сывороточном бульоне. Засеянные чашки инкубировали в атмосфере, содержащей 5% CO₂ при 37°C в течение 16-24 ч. Идентификацию выросших колоний производили методом белкового профилирования MALDI-TOF MS (время пролетная матрично-ассоциированная лазерная десорбционная ионизационная масс-спектрометрия) на анализаторе Vitek MS (BioMerieux, Франция).

В основе ускоренной методики лежит модифицированный метод интактных клеток с использованием раствора сапонина в качестве лизирующего компонента [7]. На 1-м этапе происходит осаждение крупнодисперсных частиц и лизис форменных элементов, отмывка. После этого осадок бактериальных клеток готов для нанесения на слайд. На 2-м этапе — нанесение бактериальной массы на 23 точки слайда, покрытие 1 мкл матрицы (αциано-3-гидроксикоричная кислота), высушивание, считывание прибором масс-спектров и сравнение с базой данных. Данный метод имеет некоторые преимущества перед методом экстракции: сокращается количество манипуляций и экономится время, осадок бактерий является «жизнеспособным», т.е. он пригоден для дальнейших этапов исследования (определения чувствительности к антибиотикам, ПЦР-диагностики для обнаружения генов антибиотикорезистентности, латекс-агглютинации) [8][9]. Включение в протокол этапа добавления раствора сапонина для гемолиза эритроцитов повышает чувствительность методики. Было отмечено, что некоторые бактерии, чаще всего грамположительные кокки, имеют «привязанность» к эритроцитам и могут быть удалены вместе с ними в некоторых протоколах исследования (центрифугирование в пробирках с гелем и др.) [10].

Оценка антибиотикочувствительности проводилась стандартным диско-диффузионным методом, описанным в Рекомендациях МАКМАХ «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам (2021)» и документе «EUCAST Disk Diffusion Method for Antimicrobial Susceptibility Testing — Version 7.0 (January 2019)». Пограничные значения диаметров зон подавления роста калиброваны по отношению к гармонизированным европейским пограничным значениям, которые опубликованы EUCAST и расположены в свободном доступе на сайте http://www.eucast.org.

Результаты

При оценке ретроспективных данных определяли процент выявления S. agalactiae в крови и других биоматериалах от новорожденных с января 2021 года по ноябрь 2024 года. Данный показатель при исследовании гемокультуры составил 0,9% (СГВ был выявлен в 26 пробах из 2931, из них 290 проб крови дали положительный результат по росту микроорганизмов). S. agalactiae из отделяемого нижних дыхательных путей (трахеобронхиальный аспират) выделили в 0,8% случаев (в 4 из 507 проб), из ликвора — в 0,7% (в 4 пробах из 596).

Характеристика 10 пациентов с положительной гемокультурой СГВ представлена в табл. 2.

Для оценки чувствительности S. agalactiae к антибиотикам проанализировали паттерны резистентности 180 штаммов, выделенных из цервикального канала родильниц и из биоматериалов новорожденных. Результаты представлены в таблице 3.

Результаты показали, что штаммы S. agalactiae обладают хорошей чувствительностью к бета-лактамным антибиотикам, в частности к аминопенициллинам. Резистентность к макролидным антибиотикам составляет 28,3%, к линкозамидам — 27,2%. Высокий уровень резистентности отмечается для тетрациклина — почти 80% штаммов к нему устойчивы.

Штаммы S. agalactiae, выделенные из крови (таблица 3), характеризуются такими же паттернами резистентности: высокой чувствительностью к бета-лактамам, а также чувствительностью к ванкомицину, линезолиду. Резистентность к макролидным антибиотикам составляет 30%, к линкозамидам — 30%. Высокий уровень резистентности отмечается для тетрациклина — 70% штаммов к нему устойчивы.

Для анализа времени выдачи результатов бактериологического исследования крови временная шкала обработки пробы в лаборатории была разбита на интервалы (см. рисунок 1).

В таблице 5 даны временные интервалы и общее время оборота пробы в лаборатории при работе с гемокультурой. Среднее время А составило 13,1±7,4 ч, среднее В — 6,7±3,0, среднее С — 20,2±13,1, среднее D — 42,0±12,0 ч. При использовании метода ускоренной идентификации напрямую из положительного флакона среднее время С составило 12,5 часов, D — 36,3 часа. Если по каким-то причинам ускоренная идентификация не проводилась или была неудачной: среднее время C составило почти 30 часов, среднее время D — 50,6 ч. Время роста микроорганизмов во флаконе (время В) зависит от многих факторов, на некоторые из которых повлиять невозможно, например, вид возбудителя и микробная нагрузка. Также имеет значение количество микробных клеток во флаконе — чем больше возбудителя в крови, тем быстрее флакон станет “положительным”. При этом время роста контаминантов, как правило дольше, так как бактериям с кожи нужно время на адаптацию в непривычной для них среде.

Обсуждение

Изучению качества этиологической диагностики инфекций крови было посвящено крупное исследование [13], проведенное исследовательской группой ESCMID (European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases) и ESGBIES (The ESCMID Study Group for Bloodstream Infections, Endocarditis and Sepsis) и включившее 209 лабораторий из 25 стран Европы. Полученные результаты позволили выявить основные параметры, напрямую влияющие на эффективность этиологической диагностики инфекций крови. Например, было показано, что в выходные и праздничные дни 9,3% лабораторий не принимали образцы крови, а 15,2% не обрабатывали флаконы с положительным ростом, в то же время в более 40% образцов фиксировали положительный рост именно в нерабочее время.

Только микробиологическими методами идентификации (посев на плотные питательные среды с последующей идентификацией возбудителя) ограничивались 32,5% лабораторий, а 67,5% применяли различные быстрые методы диагностики, представленные MALDI-TOF MS (59,8% лабораторий), полимеразной цепной реакцией — ПЦР (21% лабораторий). Но при этом треть всех лабораторий, даже имеющих MALDI-TOF MS, по-прежнему используют классический диагностический подход, т.е. субкультивирование на плотной среде и работу со зрелыми колониями на следующий день.

Все подходы для ускорения диагностики бактериемии условно можно разделить на три категории. Первая группа объединяет технологические подходы: ускорить диагностику бактериемии возможно путем гемокультивирование с применением автоматизированных систем в сочетании с идентификацией выросшего микроорганизма методом MALDI-TOF MS. В настоящее время она принята как новый стандарт идентификации микроорганизмов в некоторых биологических средах и теперь применяется в микробиологических лабораториях во многих странах мира [11].

Вторая группа включает методологические подходы, начало данной стратегии было положено Stevenson и соавт., которые в 2009 г. опубликовали первое сообщение об успешной идентификации микроорганизмов напрямую из положительных флаконов крови [12]. MALDI-TOF MS до этого не использовалась для идентификации непосредственно из положительных флаконов крови в силу того, что для получения приемлемого спектра необходима высокая плотность микроорганизмов, а также потому, что гемоглобин и протеины сыворотки искажают интерпретацию белкового спектра бактерий. С целью повышения надежности диагностики авторы использовали пробирки с гелем, с помощью которого добивались разделения клеточных элементов крови, белков и сыворотки. При этом для исследования собирали осадок бактериальных клеток, находящийся на поверхности геля. Затем выполняли экстракцию протеинов путем добавления муравьиной кислоты и ацетонитрила. Использование этой методики в работе с положительными гемокультурами позволило добиться успешной идентификации микроорганизмов в 75,8% случаев.

Ранее опубликованное исследование с применением собственного протокола пробоподготовки показало, что процент успешной ускоренной идентификации по всем группам бактерий составил 86,0%, при этом для грамотрицательных палочек он достигал 100%, для грамположительных кокков — 83,5% [7].

В данном исследовании метод ускоренной идентификации позволил сократить общее время от момента забора материала до момента выдачи результата врачу в среднем до 36,6 ч.

Также методологическим подходом, ускоряющим диагностику бактериемии, является идентификация микроорганизма в положительном флаконе с помощью метода ПЦР в режиме реального времени (наприме, с использованием тест-системы «БакСкринУПМ», «ДНК-технология», Россия).

К третьей группе методов относятся управленческие или организационные решения. К таким подходам можно отнести, например, изменение графика работы лаборатории, создание четких алгоритмов передачи информации клиническим врачам, установка автоматических геманализаторов для культивирования и непрерывного мониторинга роста микроорганизмов «point-of-care» и другие.

Выводы

Проведенный анализ показал, что применение ускоренной методики культурального выявления СГВ в гемокультурах новорожденных детей позволило сократить время идентификации возбудителя в положительной культуре крови на 17,5 часов с 30 часов до 12,5 (более чем в 2 раза), а общее время от получения биоматериала до принятия решения лечащим — сократить на 14 часов (с 50 часов до 36), т. е. почти в 1,5 раза.