Гиперплазия эндометрия (ГЭ) — это патологическое состояние, затрагивающее эпителиальные и неэпителиальные компартменты эндометрия, при котором нарушается баланс между железистыми, стромальными структурами и перестраивается фенотип пролиферирующих клеток [1]. Главной причиной развития этих изменений является хронический гормональный дисбаланс между прогестероном и эстрогенами, при котором преобладают фракции эстрогенов, вырабатываемых организмом и поступающих извне [2]. Непредсказуемое течение заболевания, ухудшение качества жизни, утрата репродуктивной функции и риск злокачественного перерождения требуют дальнейшего изучения механизмов развития ГЭ.

Особого внимания в генезе предрака и рака эндометрия заслуживает изучение окислительного и нитрозативного стресса. Окислительный и нитрозативный стрессы — это ключевые механизмы, запускающие хроническое воспаление и повреждение ДНК. Они являются ведущими звенья патогенетической цепочки, ведущей от предраковых изменений к злокачественным новообразованиям, вызывая мутации, подавляя противоопухолевый иммунитет и стимулируя относительно автономную пролиферативную активность клеток [3].

HIF (Hypoxia-inducible factors, гипоксия-индуцируемые факторы) — это группа ключевых транскрипционных факторов (белков), которые служат главным датчиком и регулятором клеточного ответа на гипоксию и возникающий при этом окислительный стресс. Основным и наиболее изученным представителем этого семейства является HIF-1-alpha [4]. Главным представителем и ключевым генератором нитрозативного стресса является iNOS (индуцируемая синтаза оксида азота). В отличие от конститутивных ферментов (eNOS, nNOS), iNOS запускается при воспалении и вырабатывает оксид азота (NO) в патологических количествах [5]. И если само присутствие данных процессов не вызывает сомнений ни в случае ГЭ (без атипии / с атипией) [6][7], ни при эндометриоидной аденокарциноме [8][9], то вопрос корреляционных взаимоотношений между окислительным и нитрозативным стрессом в ключе патологии эндометрия остается открытым и требует дальнейшего изучения.

Изучить структурные особенности окислительного, нитрозативного стрессов и их соотношения при гиперплазии эндометрия (без атипии / с атипией) и эндометриоидной аденокарциноме

В рамках ретроспективного нерандомизированного когортного исследования были сформированы четыре группы женщин в возрасте от 18 до 45 лет, каждая из которых включала по 30 пациенток. Критерии распределения участниц основывались на результатах морфологического анализа биоптатов эндометрия. В 1-ю группу вошли пациентки с ГЭ без атипии (n=30), во 2-ю — женщины с ГЭ с атипией (n=30), 3‑я группа состояла из пациенток с диагнозом эндометриоидной аденокарциномы (n=30), а 4‑я (контрольная, n=30) включала женщин, планирующих беременность, с морфологическими признаками эндометрия, соответствующими ранней или средней стадии секреторной фазы менструального цикла. Указанные критерии соответствовали условиям включения в исследование.

Критерии исключения предусматривали: прием гормональных препаратов (включая комбинированные оральные контрацептивы) в течение последних шести месяцев, наличие миомы матки, требующей хирургического вмешательства, эндометриоз, а также предопухолевые и опухолевые заболевания других локализаций.

Морфологические исследования проводились на клинической базе кафедры патологической анатомии и судебной медицины имени профессора В.Л. Коваленко ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России. Анализ включал гистологическое, иммуногистохимическое (ИГХ) и статистическое исследование. Все женщины подписывали добровольное информированное согласие на участие в работе и публикацию данных в анонимной форме в открытой печати. Дизайн исследования был одобрен этическим комитетом ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России (протокол № 6 от 09.09.2024).

Для гистологического анализа из парафиновых блоков изготавливались срезы толщиной 5 мкм (Meditome A 550, Medite, Германия), которые подвергались депарафинизации и окрашивались гематоксилином и эозином по стандартной методике. Исследование железистых и стромальных структур биоптатов эндометрия проводилось на оцифрованных микропрепаратах с использованием автоматизированного алгоритма анализа QuPath (США).

ИГХ-исследование выполнялось с применением готовых кроличьих поликлональных антител к HIF-1-alpha (LOT: WU06X26D8721, Elabscience, Китай) и iNOS (Wuhan Elabscience Biotechnology Co., Ltd., Китай) в рабочем разведении «ready to use». Окрашивание производилось автоматически с использованием иммуногистостейнера Ventana Benchmark XT (Ventana Medical Systems S.A., Франция). Положительная реакция с маркерами определялась по наличию коричневого окрашивания ядерных и цитоплазматических структур клеток желез и стромы эндометрия. Оцифрованные изображения гистологических препаратов, полученные с помощью сканирующего микроскопа Panoramic 250 (3D Histech, Венгрия), использовались для автоматизированного подсчета иммунопозитивных клеток. Для интерпретации данных ИГХ-анализа применялось программное обеспечение ImageJ с модулем ICH Profiler (NIH, США).

Статистическая обработка данных проводилась с использованием программы Statistica 13 (StatSoft, США). Для количественных показателей рассчитывались медиана (Ме) и квартили Q1 и Q3, представленные в формате Ме (Q1; Q3). Сравнение показателей осуществлялось с помощью критерия Краскела–Уоллиса, а попарный анализ — с использованием критерия Манна–Уитни. Для оценки взаимосвязи признаков вычислялись коэффициенты корреляции Спирмена. Статистически значимыми считались различия при уровне вероятности ошибки p<0,05.

При изучении экспрессии HIF-1-alpha в группе пациенток с ГЭ без атипии (1‑я группа) было установлено, что подавляющее большинство клеток (78,47% [ 73,32%; 84,34%]) не демонстрировали иммунопозитивной реакции на данный маркер. Иммунопозитивные клетки составили 21,53% [ 18,6%; 25,43%], причем слабая экспрессия наблюдалась исключительно в цитоплазме клеток желез, тогда как стромальный компонент оставался иммунонегативным. При исследовании экспрессии iNOS было выявлено, что подавляющее большинство клеток (73,68% [ 69,43%; 79,94%]) не демонстрировали иммунопозитивной реакции на данный маркер. Иммунопозитивные клетки составили 26,32% [ 20,68%; 34,07%], причем характерным было преимущественно слабое цитоплазматическое окрашивание клеток желез, с более выраженной интенсивностью окрашивания клеток, локализованных ближе к просвету желез. Помимо этого, в стромальном компоненте эндометрия наблюдались группы клеток, демонстрирующих экспрессию маркера iNOS. Коэффициент корреляции между показателями экспрессии HIF-1-alpha и iNOS в группе женщин с ГЭ без атипии равнялся 0,36, что свидетельствовало о слабой положительной корреляционной связи, невысокой точности прогноза и отсутствии причинно-следственной связи между этими показателями в данной группе.

Во 2‑й группе пациенток, страдающих ГЭ с атипией, экспрессия HIF-1-alpha была зарегистрирована в 58,6% [ 47,65%; 63,23%] случаев, причем маркер выявлялся как в железистых, так и в стромальных структурах, с локализацией как в цитоплазме, так и в ядрах клеток. В то же время 41,4% клеток оставались иммунонегативными. Анализ экспрессии iNOS в образцах эндометрия пациенток второй группы показал, что при гиперплазии эндометрия с атипией иммунопозитивная реакция регистрировалась в 44,22% [ 41,33%; 47,57%] случаев. Экспрессия маркера наблюдалась как в клетках желез (гландулоцитах), так и в стромальных элементах, причем окрашивание отмечалось как в цитоплазме, так и в ядрах клеток. В то же время в 55,78% [ 49,23%; 57,38%] клеточных элементов экспрессия iNOS отсутствовала. В настоящей группе коэффициент корреляции Спирмена между изучаемыми параметрами равнялся 0,68, что указывает на умеренно сильную прямую (положительную) связь между двумя переменными. В этом случае корреляция считается значимой и устойчивой, но не абсолютной, то есть в данных возможно присутствие других факторов влияния.

В 3‑й группе, включающей пациенток с эндометриоидной аденокарциномой, экспрессия HIF-1-alpha была обнаружена в 15 случаях (50%), преимущественно в цитоплазме клеток желез эндометрия. Также отмечалась иммунопозитивная реакция в клетках покровного эпителия и стромы, причем в стромальном компоненте экспрессия регистрировалась как в цитоплазме, так и в ядрах. При высокой степени дифференцировки эндометриоидной аденокарциномы экспрессия HIF-1-alpha была выраженной, тогда как при умеренной степени дифференцировки клетки преимущественно оставались иммунонегативными (97,25% [ 82,43%; 98,45%]). Анализ экспрессии маркера iNOS в стромальных структурах эндометрия пациенток 3‑й группы показал отсутствие иммунопозитивной реакции, что свидетельствует об иммунонегативности данного компонента. В то же время железистые структуры продемонстрировали иммунопозитивную реакцию, преимущественно локализованную в цитоплазматическом компартменте клеток. Кроме того, в отдельных случаях наблюдалось иммунопозитивное окрашивание ядер клеток желез. В 3‑й группе коэффициент корреляции Спирмена составил лишь 0,1, что указывает на очень слабую (практически нулевую) линейную связь между изучаемыми переменными.

В контрольной (4-й) группе, состоящей из женщин, планирующих беременность, анализ биоптатов эндометрия показал, что абсолютное большинство клеток (95,32% [ 87,65%; 98,99%]) не демонстрировали экспрессии HIF-1-alpha. Лишь в 4,68% [ 2,4%; 7,64%] клеток зарегистрирована слабая иммунопозитивную реакцию, локализованная в цитоплазме клеток покровного эпителия. В образцах неизменного эндометрия экспрессия iNOS практически не выявлялась, что характерно для подавляющего большинства биоптатов. Лишь небольшая часть клеток стромы (2,7% [ 1,23%; 7,84%]) демонстрировала слабую иммунопозитивную реакцию в цитоплазме. При этом гландулоциты оставались иммунонегативными в отношении данного маркера. В этой группе коэффициент корреляции достиг 0,77, что указывало на сильную прямую связь между изучаемыми маркерами.

Индуцибельная синтаза оксида азота (iNOS) играет важнейшую роль в онкогенезе эндометрия. Повышенная экспрессия iNOS приводит к образованию избытка NO, который реагирует с супероксидом, образуя пероксинитрит. Это соединение может повреждать различные белки и ДНК посредством нитрования, нитрозилирования и окисления, играя, таким образом, критическую роль в развитии опухолей [10]. По нашим данным, в случае ГЭ (без атипии / с атипией) и рака эндометрия биоптаты слизистой оболочки матки отличались статистически значимым повышением уровня экспрессии в отношении iNOS. Повышенная продукция оксида азота вследствие гиперэкспрессии iNOS усугубляет митохондриальную дисфункцию и обусловливает генетическую нестабильность [11].

Кислород необходим для нормальной жизнеспособности и функционирования эукариотических клеток из-за его роли в производстве митохондриальной энергии и в качестве кофактора/субстрата для многих ферментов [12]. В условиях окислительного стресса стабилизируется HIF-1-alpha, что оказывает влияние на гликолиз, ангиогенез, регуляцию pH и репарацию. HIF-1-alpha сверхэкспрессируется в широком спектре раковых опухолей человека и играет решающую роль в стимулировании роста, инвазии и метастазирования опухоли [13]. Мы продемонстрировали изменение экспрессии HIF-1-alpha в ряду от предрака к раку эндометрия.

Нами ранее уже были опубликованы данные об изменении экспрессии HIF-1-alpha в условиях предрака и рака эндометрия, и было показано, что повышенная регуляция HIF-1α приводит к нарушению дифференцировки клеток эндометрия, усилению пролиферативной активности и появлению клеточной атипии [14]. Однако в настоящем исследовании мы обратили особое внимание на изменение параметров коэффициента корреляции между показателями экспрессии в слизистой оболочке матки маркеров HIF-1-alpha и iNOS при предраке и раке эндометрия. При интерпретации данные значений мы попытались оценить характер взаимосвязи между окислительным и нитрозативным стрессом.

Так, при ГЭ без атипии коэффициент корреляции Спирмена между HIF-1-alpha и iNOS равнялся 0,36, а в случае ГЭ с атипией — 0,68. Полагаем, что отсутствие корреляции между окислительным и нитрозативным стрессом при ГЭ без атипии и ее появление при ГЭ с атипией обусловлены переходом от локального гормонального дисбаланса к геномной нестабильности. При этой форме пролиферация клеток стимулируется избытком эстрогенов на фоне дефицита прогестерона. В этом случае окислительный стресс носит в основном «компенсаторный» характер. Умеренное количество активных форм кислорода работает как сигнал, стимулирующий деление клеток. Антиоксидантная система эндометрия еще справляется с нагрузкой. Нитрозативный стресс (образование токсичного пероксинитрита из оксида азота и супероксида) выражен слабо и не связан напрямую с уровнем окислительного стресса, а клетки не повреждаются на уровне ДНК [15].

В случае ГЭ с атипией клетки эндометрия необратимо мутируют и, по мере прогрессирования болезни, адекватный контроль над достаточностью пролиферацией утрачивается, а ткань инфильтрируется иммунными макрофагами. Это вызывает мощный скачок продукции провоспалительных цитокинов, который одновременно активирует как выработку кислородных радикалов, так и фермента iNOS. Высокие уровни активных форм кислорода вступают во взаимодействие с оксидом азота, запуская реакцию с образованием пероксинитрита. Это вещество повреждает липиды, белки и, самое главное, разрывает цепи ДНК, замыкая порочный круг оксидативно-нитрозативного стресса. Ключевым фактором появления этой корреляции является хроническое воспаление и включение онкогенных путей (например, мутации PTEN), из-за которых эндометрий перестает адекватно реагировать на окислительные повреждения [16].

При эндометриоидной аденокарциноме, по нашим данным, соответствующий коэффициент корреляции между параметрами экспрессии HIF-1-alpha и iNOS равнялся лишь 0,1. Мы полагаем, что это объясняется глубокой метаболической перестройкой («репрограммированием») опухолевых клеток. При доброкачественном разрастании ткани эндометрия (ГЭ без атипии) стресс носит зависимый и синхронный характер, тогда как при раке эти системы работают автономно. При ГЭ избыток эстрогенов вызывает синхронное образование как свободных форм кислорода, так и оксида азота. В злокачественной опухоли ферментные системы, такие как iNOS, начинают функционировать хаотично, образуя радикалы в разных компартментах клетки и в разное время. Помимо этого, опухолевые клетки используют оксид азота для пролиферации, подавления апоптоза и стимуляции ангиогенеза. В результате NO активно утилизируется специфическими путями, не успевая вступать во вторичные реакции с АФК (например, образование пероксинитрита), что нарушает линейную корреляцию, характерную для фоновых процессов. К тому же раковые клетки эндометрия активируют собственные мощные механизмы защиты (например, тиоредоксиновую и глутатионовую системы). Они избирательно нейтрализуют только те формы свободных радикалов, которые могли бы запустить их собственную гибель (апоптоз), оставляя другие радикалы для поддержания роста опухоли [17].

Наибольшая корреляционная связь между экспрессией iNOS и HIF-1-alpha зарегистрирована в эндометрии секреторной фазы — 0,77. Полагаем, что этому существует следующее объяснение. Согласно литературным данным, настоящая корреляция объясняется их тесной физиологической связью в регуляции менструального цикла. Так, в эндометрии во время секреторной фазы естественным образом падает уровень кислорода, что приводит к повышению уровня синтеза HIF-1-alpha. Для обеспечения этого процесса, а также для последующей десквамации, эндометрий активирует воспалительные пути, включая повышение экспрессии iNOS. Кроме того, в секреторную фазу — фазу подготовки к имплантации — эндометрий переходит в состояние умеренной физиологической гипоксии. HIF-1-alpha стимулирует выработку сосудистого эндотелиального фактора роста для формирования новых сосудов, а iNOS обеспечивает необходимый уровень NO для расширения этих сосудов и регуляции локального иммунитета, создавая оптимальные условия для эмбриона [18].

Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об изменении корреляционной связи между окислительным и нитрозативным стрессом в условиях нормального эндометрия, слизистой оболочки матки при ей гиперплазии, а также при раке эндометрия. Это объясняется особенностями метаболических процессов в слизистой оболочке матки и требует дальнейшего изучения и интерпретации патоморфологических перестроек при патологии матки.

ДЕКЛАРАЦИЯ О НАЛИЧИИ ДАННЫХ: данные, подтверждающие выводы настоящего исследования, можно получить у контактного автора по обоснованному запросу. Данные и статистические методы, представленные в статье, прошли статистическое рецензирование.

СООТВЕТСТВИЕ ПРИНЦИПАМ ЭТИКИ: проведенное исследование соответствует стандартам Хельсинкской декларации (Declaration Helsinki), одобрено этическим комитетом ФГБОУ ВО ЮУГМУ Минздрава России (протокол № 6 от 09.09.2024).

ВКЛАД АВТОРОВ:

Е.Л. Казачков, Э.А. Казачкова — концепция и дизайн исследования; А.В. Затворницкая — сбор и обработка материала; А.В. Затворницкая — написание текста; Е.Л. Казачков, Э.А. Казачкова — редактирование.

Все авторы одобрили финальную версию статьи перед публикацией, выразили согласие нести ответственность за все аспекты работы, подразумевающее надлежащее изучение и решение вопросов, связанных с точностью и добросовестностью любой части работы.

DATA AVAILABILITY STATEMENT: Data supporting the findings of this study are available from the corresponding author upon reasonable request. The data and statistical methods presented in the study have been statistically reviewed by the journal editor, a certified biostatistician.

COMPLIANCE WITH ETHICAL STANDARDS: The study was conducted in accordance with the requirements of the Helsinki Declaration and approved by this committee of the Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education SUMU of the Ministry of Health of the Russian Federation (protocol No. 6 dated 09.09.2024).

AUTHORS’ CONTRIBUTIONS:

Evgeny L. Kazachkov, Ella A. Kazachkova — study concept and design; Aleksandra V. Zatvornitskaya — data collection and processing; Aleksandra V. Zatvornitskaya — writing; Evgeny L. Kazachkov, Ella A. Kazachkova — editing.

All authors approved the final version of the article before publication and agreed to be accountable for all aspects of the work, including ensuring that any questions related to the accuracy and integrity of any part of the work are properly investigated and resolved.